Akcję utworu autor umieścił w mieście gubernialnym (może nim być Perm). W dramacie uczestniczy - oprócz tytułowych sióstr: Olgi, Maszy i Iriny Prozorow, ich brata Andrzeja i jego żony Nataszy - grupa wojskowych średniej rangi, odbywających w tym mieście służbę garnizonową.
Znakomicie wykształcone, a niedawno osierocone przez ojca, również wojskowego, siostry Prozorow starym zwyczajem podejmują w swym domu gości z tego środowiska. Ani najstarszej z sióstr, Oldze, ani najmłodszej - Irinie, praca w szkole czy telegrafie nie daje żadnego zadowolenia. Masza z kolei, uzdolniona muzycznie, już od wielu lat nie zajmuje się grą na fortepianie, więdnąc przy boku męża, Kułygina - naiwnego optymisty i wesołka. Andrzej Prozorow, usidlony przez Nataszę przeradzającą się stopniowo w domowego tyrana i siewcę niezgody w rodzinie (zachwyca się tylko własnymi dziećmi), lekkomyślnie trwoni majątek i staje się ruiną człowieka.
Najgłębszym marzeniem sióstr - umiejących, jak twierdzi Masza, "tyle niepotrzebnych rzeczy" - jest porzucenie nudy życia na prowincji i powrót do Moskwy, z której pochodzą. Wydaje im się, że tam właśnie czeka na nie "prawdziwe życie", jednoczące "ciało" z "duchem": miłość i szczęście rodzinne, satysfakcjonująca praca, uznanie otoczenia, oddani przyjaciele. Za pracą stanowiącą rękojmię życiowego spełnienia, pełni człowieczeństwa tęsknią także inne postacie dramatu, zwłaszcza pułkownik Wierszynin - życiowy bankrut i rodzinny rozbitek, oraz baron Tuzenbach, który przyznaje, że sam pracą nigdy się nie splamił.
Zagrzebane w błahych okolicznościach postacie dramatu, mimo świadomości istnienia sfery idei i wyobraźni, nie są w stanie wyzwolić się z pęt ponurej przyziemności, obłudy i pozorów. Istnienie w takim świecie jest właściwie nieistnieniem, popadnięciem w niebyt. W tej sytuacji paradoksem jest, iż rację ma lekarz Czebutykin - sam ubogi wewnętrznie i całkowicie zobojętniały na wszystko, co dzieje się wokół - gdy cynicznie stwierdza: może nam w ogóle się zdaje, że żyjemy, a w rzeczywistości nie ma nas. Odczuwa się w tych słowach typowo czechowowską, straszliwą ironię bezlitosnej prawdy o ludziach, którzy zamiast otwierać - zamykają perspektywę na pełne wyrazu życie, które wszak winno każdemu dać szansę przejawienia aktywności, oraz - nieustannie błądząc - pozostają obojętni na jego urok i bogactwo.